病原学诊断

　　A1 诊断急性甲型肝炎病毒（HAV）感染的血清学检查

　　本标准要求采用MACELISA（IgM抗体捕捉酶联免疫吸附试验）检测血清抗HAV－IgM，使用的试剂盒应有卫生部批准的生产文号。

　　A1.1 MAC ELISA检测抗HAV－IgM的方法

　　A1.1.1 液体配制

　　A1.1.1.1 包被液（碳酸盐缓冲液pH9.6）

　　碳酸钠0.16g，碳酸氢钠0.29g加蒸馏水至100mL。

　　A1.1.1.2 洗涤液（PBS－Tween－20缓冲液pH7.4）

　　氯化钠8g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠（12个结晶水）2.9g，氯化钾0.2g，Tween－20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL。

　　A1.1.1.3 稀释液（10％小牛血清PBS－Tween）

　　上述PBS－Tween－20 90mL加小牛血清10mL。

　　A1.1.1.4 底物液

　　0.1mol／L磷酸氢二钠5.14mL，0.05mol／L柠檬酸4.86mL，邻苯二胺（OPD）4mg，溶解后加3％双氧水，0.05mL（临用配制）。

　　A1.1.1.5 终止液

　　2mol／L H2SO4。

　　A1.1.2 操作步骤

　　A1.1.2.1 包被：用包被液将抗人IgM（μ链特异性）纯品按确定的倍数稀释后加入塑料微孔反应板，每孔0.1mL，放4℃过夜。倾去液体，用洗涤液洗3次，拍干。

　　A1.1.2.2 加样：血清标本用稀释液按1∶1000稀释，每孔各加入0.1mL，并设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白对照1孔，放37℃，温育4h，洗涤3次，拍干。

　　A1.1.2.3 加抗原：加HAV－Ag（细胞培养增殖）每孔0.05mL，置4℃过夜。洗涤3次，拍干。

　　A1.1.2.4 加酶结合物：用稀释液将抗HAV-HRP按确定的倍数稀释，每孔加入0.1mL（空白对照孔不加）。置37℃温育2h，洗涤3次，拍干。

　　A1.1.2.5 显色：加新鲜配制的底物液，每孔0.1mL，37℃显色15min，每孔加终止液0.05mL。

　　A1.1.3 结果判定

　　目测法：显色为阳性；无色或极淡黄色为阴性。

　　比色法：用酶标比色计，波长492nm，空白孔校零点，读取各孔的光密度（OD），并计算界限值（cut off value；COV）。

　　COV＝阴性对照平均OD值×2.1（如阴性对照OD值＜0.05，按0.05计算），凡标本OD值＞COV判为阳性，标本OD值＜COV判为阴性。

　　A1.2 急性HAV感染的病原血清学诊断标准

　　血清抗HAV－IgM为急性HAV感染的血清学标志。血清抗HAV-IgM阳性可作为诊断急性HAV感染的依据。

　　A2 诊断急性甲型肝炎病毒感染的血清学检查

　　本标准要求采用竞争抑制ELISA检测血清抗HAV（HAV总抗体），使用的试剂盒应有卫生部批准的生产文号。

　　A2.1 竞争抑制ELISA检测抗HAV的方法

　　A2.1.1 液体配制（同A1.1.1）

　　A2.1.1.1 包被：用包被液将纯化的抗HAV－IgG按确定的倍数稀释后加入塑料微孔反应板，每孔0.1mL，置4℃过夜，倾去液体，用洗涤液洗3次，拍干。

　　A2.1.1.2 加抗原：加HAV－Ag（细胞培养增殖）每孔各0.05mL，置4℃过夜，洗涤3次，拍干。

　　A2.1.1.3 加血清标本和酶结合物：加血清标本，每孔0.005mL，并设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白对照1孔，再加已用稀释液按确定倍数稀释的抗HAV－HRP，每孔0.1mL（空白孔不加），轻摇混匀，置37℃2h，洗涤3次，拍干。

　　A2.1.1.4 显色：加新鲜配制的底物，每孔0.1mL，置37℃显色15min，每孔加终止液0.05mL.

　　A2.1.2 结果判定

　　目测法：阴性为棕黄色；阳性为无色或淡黄色。

　　比色法：使用酶标比色计，波长492nm，以空白孔校零，读取各孔OD值，并计算界限值（COV）。

　　COV＝（阴性对照平均OD值＋阳性对照平均OD值）／2，凡标本OD＞COV判为阴性，标本OD＜COV判为阳性。

　　A2.2 HAV感染的病原血清学检查诊断标准

　　抗HAV是HAV感染的血清学标志，血清抗HAV阳性者可作为诊断HAV感染（包括既往HAV感染）的依据。