免疫学诊断方法
　　A1 间接红细胞凝集试验（IHA）
　　A1.1 抗原制备
　　用2.5％戊二醛醛化的绵羊红细胞，经终浓度1∶20000鞣酸处理后，以最适浓度的囊液粗抗原或纯化的抗原致敏。致敏后的红细胞以含10％蔗糖及1％正常兔血清的pH7.2PBS配成5％悬液分装安瓿（1mL／支），置4℃冰箱保存或冻干封存（0.2mL／支）。使用浓度为1％。
　　A1.2 操作方法
　　A1.2.1 准备抗原：如为冻干产品，则加入1mL蒸馏水稀释混匀备用。
　　A1.2.2 用微量滴管滴加1％兔血清－磷酸缓冲盐水于V型微量反应板上第一孔加3滴，其余各孔均为1滴（25μL）；至少做六孔。第一孔加待检血清1滴（25μL）即血清稀释度为1∶4；混匀后从中吸取血清1滴加入第二孔；混匀，依次作倍比稀释；最后一孔混匀后吸弃1滴。并平行做阴性、阳性对照。
　　A1.2.3 从第二孔起，每孔加入致敏红细胞悬液1滴（25μL）；立即振摇1min；加盖板，室温下静置1h，观察结果。
　　A1.3 结果判断
　　A1.3.1 阴性反应：红细胞全部沉入孔底呈点状，边缘光滑。
　　A1.3.2 阳性反应：以血清1∶128稀释出现阳性反应者（++或+++）判为包虫血清抗体阳性。
　　+++ 红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底或边缘有皱褶。
　　++ 红细胞形成薄层凝集，面积较小，边缘松散。
　　+ 红细胞大部分沉于孔底，形成一圆点或圆圈，周边模糊或中心有白色小点。
　　A2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
　　A2.1 抗原
　　包虫囊液纯化抗原（磷钨酸、氯化镁沉淀法制备）。
　　A2.2 操作方法
　　A2.2.1 抗原包被聚苯乙烯板：用0.05mo1／LpH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入100μL，置温盒。4℃过夜（或12～24h），次日，倾去抗原，用含0.05％吐温20磷酸缓冲盐水（0.01mol／L，pH7.4 PBS－T）洗涤3次，每次5min，甩干。
　　A2.2.2 加待检血清：血清用PBST作1∶200稀释，每凹孔加入100μL，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，37℃1h，然后取出，倾去血清，洗涤同前。
　　A2.2.3 加结合物：加入用PBS－T作工作稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）－标记结合物100μL，37℃，1h倾去结合物，洗涤同前。
　　A2.2.4 加底物：通常加邻苯二胺（OPD）底物溶液（10mg OPD＋25mL pH5.0柠檬酸缓冲液＋30％H₂O₂ 10μL）100μL，37℃，30min。
　　A2.2.5 加中止液：2mol／L H₂SO₄50μL。
　　A2.3 结果判断
　　在酶标专用比色计上读取492nm OD值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的S／N值≥2.1为阳性临界值。
　　A3 PVC薄膜快速ELISA
　　A3.1 抗原
　　包虫囊液纯化抗原。
　　A3.2 操作方法
　　A3.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜软板，编号，用PBS-T洗一次，然后每孔加PBS－T200μL；
　　A3.2.2 加待检血清及参考血清（每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔）每凹孔10μL，混匀，置湿盒37℃ 5min（或25℃室温10min）。倾去血清，用PBS－T连续洗8次，甩干。
　　A3.2.3 加酶结合物：按工作浓度稀释，每孔200μL，37℃ 5min，倾去结合物，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干。
　　A3.2.4 加入底物溶液：含3％H₂O₂的TMB底物，每凹孔200μL，反应5～10min（TMB底物溶液的制备：TMB50mg溶于10mL二甲基亚砜中作为母液，4℃保存。用前取母液1mL＋pH5.0柠檬酸缓冲液50mL＋30％H₂O₂8μL）。
　　A3.3 结果判断
　　按每批的阴性及阳性对照目视判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。
　　A4 酶联免疫印渍技术（EITB）
　　A4.1 抗原膜条制备
　　采用5％～20％厚0.75mm梯度胶，包虫囊液抗原按1μg／mm加入，上槽缓冲液为0.1mol／L硼酸缓冲液，下槽液为0.424mol／LpH9.18Tris／HCl，抗原经SDS－PAGE电泳分离后，再经转移电泳。转移电泳液为0.212mol／L pH9.18Tris／HCL，含20％甲醇电泳30min，即将分离的抗原蛋白带由凝胶转移到硝酸纤维膜上，此膜用PBS－T洗3次，PBS洗1次，每次5min，然后将膜切成3mm宽的长条，此为抗原膜条，夹于PBS湿滤纸中封于塑料袋，保存于冰箱中备用，若存于低温冰箱，可长期保存。
　　A4.2 操作方法
　　A4.2.1 试验时，将膜取出或解冻。先于反应槽中加入495μL含5％脱脂奶粉及3％吐温PBS，再加入5μL待检血清，最后加入抗原膜条，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇1h（4℃可过夜）。次日，用0.3％吐温－PBS洗4次，每次5min吸干。
　　A4.2.2 加入工作浓度稀释的结合物，室温1h，洗涤同前。
　　A4.2.3 加入DAB－H₂O₂系统（25mg3，3′－二氨基联苯胺＋50mL无吐温PBS＋5μL H₂O₂）显色10min，自来水冲洗中止反应，晾干。
　　A4.2.4 判读结果：目测特异性条带，以60KD、36KD、32KD、24KD、20KD、17KD和12KD为阳性条带。其中只要出现12KD、17KD、24KD条带即可判为阳性。
　　A5 循环抗原检测
　　A5.1 将抗包虫单克隆抗体用0.05mol／L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜后用PBS－T洗板3次。
　　A5.2 每孔加入含10％小牛血清的PBS-T 100μL，于37℃下封板1h，洗板3次。
　　A5.3 待检血清用上液稀释为1∶2，每孔加100μL，每份标本加两孔，37C温育1h，洗板3次。
　　A5.4 加入工作浓度的HRP标记单抗100μL 37℃ 1h后，洗板3次。
　　A5.5 加入OPD底物溶液100μL，37℃ 30min.
　　A5.6 加入2mol／L H₂SO₄50μL，终止反应。
　　A5.7 测各孔OD₄₉₀。
　　A5.8 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（5～10μg／mL抗原100μL），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值＋3SD为阳性临界值。
　　A6 循环免疫复合物检测
　　A6.1 用0.01mol／L pH8.4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7％溶液，取此液100μL加等量1∶2待检血清混合置室温下1h后，3000r／min离心1h。
　　A6.2 吸去上清液，在沉淀中加含有8mol／L尿素的0.05mol／L pH9.6碳酸盐缓冲液0.5mL，溶解沉淀物。
　　A6.3 用此液包被酶标板每孔100μL，每份标本包被两孔，4℃过夜后，洗板3次（阳性及阴性对照同样处理）。
　　A6.4 每孔加含有10％小牛血清的PBS－T100μL，37℃封板1h，洗板3次。
　　A6.5 加入工作浓度HRP标记的抗包虫单克隆抗体100μL，37℃下1h后洗板3次。
　　A6.6 加OPD底物100μL，37℃下30min.
　　A6.7 加入2mol／L H₂SO₄50μL终止反应。
　　A6.8 测各孔OD₄₉₀。
　　A6.9 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（同6.8项），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十3SD为阳性临界值。
　　A7 泡型包虫病特异性EITB技术
　　A7.1 抗原膜条制备及免疫印渍试验
　　A7.1.1 收取人工感染多房棘球蚴的长爪砂鼠腹腔中的包囊，剪碎后收集原头节，反复洗涤后，用去氧胆酸钠溶液溶解并抽提后，用PBS透析，收集抗原，测定蛋白质含量并调整至2mg／mL浓度。
　　A7.1.2 用12％或20％浓度聚丙烯酰胺凝胶或8％～16％梯度胶（厚1.5mm）按常规进行SDSPAGE电泳。在长度为6cm的胶上每一大孔加蛋白质400μg.电泳后按常规转移至硝酸纤维膜上（孔径0.45μm）。然后切成膜条，进行免疫印渍试验。待检血清稀释1∶50。
　　A7.2 结果解释：在分子量为18KD位置出现酶免疫染色条带者为阳性。考试大收集整理

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