血清学诊断方法
　　B1 血凝抑制试验
　　B1.1 原理
　　鹅红细胞（或鸽红细胞）上有风疹病毒受体，遇风疹病毒可产生凝集现象。若将抗体与病毒（血凝素）预先温育后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制。定量血凝素与不同稀释度抗体（血清）作用后能完全抑制血凝的最高血清稀释度，即为血凝抑制抗体效价。
　　B1.2 主要材料
　　B1.2.1 血凝板：6×12或8×12个圆形孔（孔底光滑）的U形板。
　　B1.2.2 定量移液器：定量移液器选用25μL（即0.025mL）。
　　B1.2.3 尖底小试管：形如离心管，便于血清的吸取。
　　B1.3 风疹血凝素的制备
　　取毒种感染BHK₂₁细胞或Vero细胞，常规换液培养。末次换入2％牛血清199综合培养基，置33℃培养6～7天以上，待细胞病变十十十时收获，冻化，取上清液用Tween－80乙醚处理即为血凝素；如用白陶土处理的2％牛血清配制感染细胞的培养基来制备血凝素，则不用Tween－80乙醚处理。
　　B1.4 血凝滴度
　　所用溶液一律置4℃预冷，微量塑料板法。血凝素用葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲液以1∶2倍比递增稀释，再加0.25％新鲜鹅红细胞（或鸽红细胞）悬液，混匀，置4℃至少1h，观察结果，以“＋＋＋＋”（4单位）的最高稀释度为血凝滴度。
　　B1.5 血凝抑制试验
　　原血清0.1mL＋0.7mL氯化锰肝素液，4℃作用20min后在1∶8稀释的血清中加1滴积压鹅红细胞（或鸽红细胞），1h内摇2～3次，置4℃过夜，再以2000r／min的速度离心10min，取上清液待检。待检血清用pH6.2的葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲液倍比稀释后，每孔加0.025mL血凝素（含4单位；如系pH9的血凝素，事先应用0.1mol／L盐酸调至pH6.2左右再用）。抗原抗体在4℃作用1h后加入0.25％鹅红细胞1滴（0.025mL），在4℃下作用2h后判定结果，以完全抑制血凝为终点。每次试验预设以下对照：
　　阳性血清对照：应出现一定已知效价
　　阴性血清对照：应出现阴性结果
　　待检血清对照：应无非特异性凝集
　　抗原对照：应出现＋＋＋＋＋（4单位）、＋＋＋（2单位）、＋＋～＋（1单位）、±（1／2单位）的凝集现象
　　血球对照：应为阳性
　　HI抗体阳性标准判定以1∶16作为阳性标准。
　　葡萄糖－明胶－巴比妥缓冲剂（DGV）配制：
　　巴比妥 0.58g
　　巴比妥钠 0.38g
　　明胶 0.6g
　　无水CaCl₂　0.02g
　　MgSO4₄H2O　0.12g
　　NaCl 8.5g
　　葡萄糖 10g
　　巴比妥与明胶可分别先各在250mL蒸馏水中加温溶解，然后依次加入其他药品，溶解后加双蒸水至1000mL，分装10瓶消毒。用前以0.1mol／L盐酸将pH调至6.2，用于稀释待测血清、配制血凝素及红细胞。
　　氯化锰－肝素液配制
　　MnC_l2 3.96g
　　肝素 16万单位
　　加双蒸水至100mL，使用时以双蒸水稀释4倍（1∶3）。
　　B2 酶联免疫吸附法检测风疹IgG抗体（ELISA间接法）
　　B2.1 原理
　　将风疹抗原包被于固相载体上，加上待检血清，再用酶标抗抗体间接检出特异性抗体。
　　B2.2 材料
　　B2.2.1 聚苯乙烯酶标板。
　　B2.2.2 风疹阴性和阳性血清。
　　B2.2.3 风疹抗原。
　　B2.2.4 抗入IgG辣根过氧化物酶结合物。
　　B2.2.5 酶底物邻苯二胺－双氧水。
　　B2.3 操作程序
　　B2.3.1 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释风疹抗原与未感染风疹病毒的细胞抗原（对照抗原）。
　　B2.3.2 于40孔聚苯乙烯板的单排孔与双排孔分别加入0.1mL／孔的风疹抗原与对照抗原。右下最后一孔不加任何抗原作为空白对照，4℃过夜。
　　B2.3.3 以0.05％Tween 20生理盐水（NS－T）洗板三次，倒去洗液。
　　B2.3.4 在血凝板中以2％牛血清NS－T将待测血清稀释成1：20～1：1280四个稀释度，每个稀释度加风疹抗原与对照抗原各1孔（0.1mL，下同），轻轻振摇后置37℃1～2h.
　　B2.3.5 以NS－T洗三次，倒去洗液后每孔加入以2％牛血清NS－T稀释的抗人IgG辣根过氧化物酶结合物0.1mL（空白对照不加），置37℃1～2h。
　　B2.3.6 以NS－T洗三次，倒去洗液后加邻苯二胺－双氧水底物液，每孔0.1mL（包括空白对照孔），避光在37℃放置10～20min，随时观察，待对照孔开始显淡黄色时即用2mol／L硫酸终止，每孔加50μL。
　　B2.3.7 用空白对照孔调零点，以酶标仪（492nm）测定各孔OD值。OD值不足0.05者按0.05计。凡同一稀释度下风疹抗原孔OD值／对照抗原孔OD值＞2.1即P／N为阳性。阳性之最高稀释度的倒数即为该血清的抗体效价。小于1∶20者视为阴性。
　　B2.3.8 每次实验应作已知效价的阳性及阴性血清对照。
　　B3 酶联免疫吸附法检测风疹IgM抗体（抗体捕捉ELISA法）
　　B3.1 原理
　　利用包被在固相载体上的抗人IgMμ链抗体，捕捉待检血清中的IgM，再用风疹病毒抗原和已知的酶标风疹病毒抗体去检测血清中IgM是否为抗风疹抗体。利用底物使酶显色而测知。
　　B3.2 材料
　　B3.2.1 聚苯乙烯40孔或96孔板。
　　B3.2.2 抗人IgMμ链抗体。
　　B3.2.3 风疹病毒抗原和正常对照抗原。
　　B3.2.4 抗风疹病毒抗体（单克隆或多克隆）。
　　B3.2.5 酶标抗抗体：抗风疹病毒抗体和酶标抗抗体也可用酶标抗风疹病毒抗体代替。
　　B3.2.6 酶底物－邻苯二胺及双氧水。
　　B3.2.7 已知的风疹IgM抗体阳性和阴性血清。
　　B3.2.8 包被液：0.05mol／L碳酸盐缓冲液（PH9.6）
　　无水碳酸钠 159mg
　　碳酸氢钠 293mg，使用不超过2周
　　蒸馏水 加至100mL
　　B3.2.9 洗涤液（NS－T）：0.85％盐水的吐温液
　　氯化钠 17g
　　吐温 201.0mL
　　蒸馏水 加至2000mL
　　B3.2.10 稀释液为5％牛血清的NS－T液。
　　B3.2.11 邻苯二胺－过氧化氢底物液
　　先配柠檬酸磷酸缓冲液（PH5.0）：
　　磷酸氢二钠 18.41g
　　柠檬酸 5.1g
　　蒸馏水 加至1000mL，分小瓶冰冻保存
　　临用时配底物液：
　　邻苯二胺（OPD）4mg
　　柠檬酸磷酸缓冲液10mL
　　30％双氧水 5mL
　　B3.3 操作
　　B3.3.1 包被抗人IgMμ链抗体，每孔100μL。
　　B3.3.2 4℃过夜，倒掉液体，用10％牛血清NS－T液120μL封闭。
　　B3.3.3 37℃1h后倒去封闭液，洗三次。
　　B3.3.4 加待测血清（1∶100稀释，即1μL待测血清加100μL稀释液），每孔100μL.每份血清加2孔（或4孔），37℃2h后洗三次。
　　B3.3.5 加风疹抗原于1孔（或2孔）中，每孔100μL；另1孔（或2孔）中加正常对照抗原，4℃过夜后，洗三次。
　　B3.3.6 加风疹单克隆抗体每孔100μL，37℃1.5h后倒去抗体，洗三次。
　　B3.3.7 加酶标记的抗鼠抗体，每孔100μL，37℃1.5h后倒去抗鼠抗体，洗4次，扣干。
　　B3.3.6与B3.3.7两步，亦可用加酶标抗风疹单克隆（或多克隆）抗体一步所取代，每孔加100μL，37℃水浴2h，洗三次再扣干。
　　B3.3.8 加底物邻苯二胺－双氧水，每孔100μL，37℃10～20min。
　　B3.3.9 加终止酶的反应液即2mol／L硫酸，50μL／孔，判定结果。
　　B3.4 结果的判定
　　B3.4.1 肉眼判定法：待检血清与风疹抗原孔呈明显的棕色反应，正常对照抗原孔不（或微）显色，两者能用肉眼明显察觉者即为阳性。
　　B3.4.2 用酶标仪的492nm光源测OD值，血清的P／N≥2.1时为阳性（P为待测血清与风疹抗原作用的OD值，N为待测血清与正常对照抗原作用的OD值）。
　　在用待测血清与已知风疹阴性血清对比时，则P为待测血清与风疹抗原作用后的OD值，N为标本阴性血清与风疹抗原作用后OD值。考试大收集整理

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