作者姓名：李慧艳
　　论文题目：CUEDC2通过抑制IKK复合体磷酸化下调NF-kB通路
　　作者简介：李慧艳，女，1978年02月出生，2004年09月师从于军事医学科学院张学敏教授，于2007年07月获博士学位。

　　中文摘要
　　CUEDC2(CUE Domain Containing 2)目前是一个功能未知的蛋白质，通过生物信息学分析发现，CUEDC2 包含一个CUE结构域。CUE是一个非常小的中度保守的结构域，大约包含40个氨基酸，预测它能和泛素结合，既能识别单泛素化又能识别多泛素化，目前发现它存在各种真核蛋白质中。最近, 我们实验室发现CUEDC2能够和孕激素受体结合，促进孕激素诱导的受体的泛素化和降解（张佩景等， EMBO J.），并抑制乳腺癌细胞的生长，这就为CUEDC2在乳腺癌增殖过程中的作用提供了重要的线索。本文为进一步揭示CUEDC2的功能，在应用酵母双杂交技术筛选与CUEDC2相互作用蛋白质的基础上，对其功能尤其是在NF-kB通路中的作用进行了更为深入的研究。
　　IKK (IkBa kinase )是一个很大的蛋白复合体，大小约为700－900kDa，包含两个激酶亚单位IKKa (IKK1) 和 IKKb (IKK2)，和一个调节亚单位NEMO (NF-kB essential modifier)或IKKg。IKKa和 IKKb都属于丝/苏氨酸激酶。IKKb是IKK蛋白激酶复合体中起催化作用的主要亚基，在经典通路中IkBs的磷酸化主要是由IKKb介导的。Delhase 等在1999年发现IKKb的激活环区的Ser177和Ser181两个磷酸化位点对于TNFa和IL-1诱导的IKK的激活是最关键的。而被激活的IKKb在其C端的丝氨酸簇可以发生自身磷酸化而降低自身活性。IKK复合体的活性调节涉及多种复杂的机制，尤其是在NF-kB信号转导通路调节过程中起着非常重要的作用。
　　NF-kB是细胞因子诱导的主要转录因子，其激活后可诱导表达一些抗凋亡的基因，对于大多数细胞的存活至关重要。在大多数的静息细胞中，NF-kB蛋白质通过与抑制蛋白家族IkB结合而存在于胞质中。 NF-kB的激活可以通过多种方式。但是大多数情况下都要先激活IKK, 降解 IkB，最后激活NF-kB。NF-kB通路经典的激活方式，比如细胞外刺激如肿瘤坏死因子（TNF）和白介素1（IL-1）可以激活IKK复合体，进而磷酸化IkB蛋白，磷酸化的IkB蛋白再被泛素蛋白酶体降解，使NF-kB得以释放，这一过程使NF-kB蛋白质入核并与特异的DNA序列结合，从而启动NF-kB下游靶基因的转录。由此可见IKK是NF-kB活性调节的关键中心环节。
　　GADD34蛋白（生长抑制和DNA损伤蛋白34）最初被发现在各种应激刺激和DNA损伤，如紫外线照射和蛋白质错误折叠中被诱导表达。现在知道GADD34是蛋白磷酸酶1（PP1）全酶的一个调节亚基，并且在TGFb I 型受体去磷酸化过程中发挥作用。PP1是一种蛋白磷酸酶，属于丝/苏氨酸磷酸酶，即可以引起丝/苏氨酸的去磷酸化作用。目前已知的蛋白磷酸酶家族包括很多亚型，比如PP2A、PP2B、PP2C等等，这些亚型又包括很多亚基，即调节亚基和催化亚基等。调节亚基主要是识别底物的作用，而真正起去磷酸化作用的是催化亚基，正常情况下，只有调节亚基和催化亚基共同存在时，蛋白磷酸酶才能发挥作用。
　　NF-kB通路激活过程中，首先TNF结合TNFR-I（TNF I型受体）导致TRADD、RIP、TRAF2等招募至受体复合体。其他的招募蛋白，如TRAF2能够招募IKK复合体至TNFR-I复合体,RIP在IKK的激活中起非常重要的作用。过表达这些蛋白能够激活NF-kB信号通路，我们结果发现CUEDC2能够有效的抑制IKKb、 TRADD、 TRAF2以及RIP过表达诱导的NF-kB的转录活性。CUEDC2对IKKb持续激活型(SS/EE)以及p65过表达引起的NF-kB转录活性没有抑制作用。根据我们的实验结果，我们认为CUEDC2对NF-kB信号通路的抑制作用在IKK水平。另外，我们证明了CUEDC2能够抑制TNFa刺激的IKKa及IKKb的磷酸化，并且在体外激酶实验中验证了CUEDC2能够抑制IKKb的激酶活性。这些数据为CUEDC2抑制NF-kB信号通路提供了重要的线索。
　　在细胞因子诱导的NF-kB通路激活中，IkB 激酶IKKa和IKKb的激活是关键的步骤。因此，对IKK复合体磷酸化的精确调控是NF-kB通路信号传导的重要组成部分。我们通过研究发现一个未知功能的蛋白CUEDC2能够结合IKKa和IKKb，并且能够通过使IKKa和IKKb去磷酸化而抑制NF-kB信号通路。利用siRNA抑制内源CUEDC2表达导致TNF诱导的NF-kB转录活性增加，过表达CUEDC2增加了细胞对凋亡信号如TNF诱导的凋亡。我们还发现CUEDC2与蛋白磷酸酶1（PP1）的调节亚基－GADD34（调节亚基生长抑制和DNA损伤蛋白34）存在相互作用。此外，我们发现CUEDC2对NF-kB信号通路的抑制是由IKK-CUEDC2-GADD34-PP1复合体介导的。siRNA抑制内源CUEDC2的实验证明CUEDC2对于IKK-CUEDC2-GADD34复合体的形成是必须的，并且作为招募蛋白使IKK去磷酸化。目前虽然对NF-kB信号通路中的许多激酶已有研究，但磷酸酶在NF-kB信号通路中发挥的作用并不是十分清楚。我们的研究证明PP1c通过CUEDC2招募至其底物IKK，并使IKK发生去磷酸化。总之，我们发现了一个新的抑制NF-kB信号通路的蛋白质，对CUEDC2在NF-kB信号通路中的作用提供了重要线索。

　　关键词：  CUDEC2, GADD34, PP1, IKK, NF-kB